Sisältö
Solujen geneettinen sininen koodataan sen geneettisessä materiaalissa tai DNA: ssa. Koska DNA ei koskaan poistu solun ytimestä, jotta tämä tieto pääsee sytoplasmaan, jossa muut proteiinit ja biokemialliset komponentit sijaitsevat, on ensin tarpeen transkriptoida DNA viesti-RNA: ksi (mRNA tai poly (A) RNA). Tämä mRNA muuttuu sitten proteiineiksi, jotka suorittavat monia solun toimintoja. Hyvin harvinaisten mRNA: iden havaitsemiseksi tai kvantifioimiseksi, koettimien tekemiseksi mikromaailmille tai rakentamiseksi komplementaaristen DNA-molekyylien kirjastoja, mRNA on eristettävä. Kokonais-RNA: n (ts. Kaiken RNA: n solussa) uutto ja sitä seuraava mRNA: n eristäminen eivät kuitenkaan ole toisiaan poissulkevia prosesseja; edellinen on suoritettava mRNA: n uuttamiseksi.
MRNA: n eristäminen kokonais-RNA: sta
TRIzol-homogenointi: Kokonais-RNA sisältää kaikki mRNA-, siirto-RNA-, ribosomaalinen RNA- ja muut koodaamaton RNA: t. Niiden erottamiseksi muista solukomponenteista solu pursotetaan ensin sen sisällön vapauttamiseksi. Tämä tehdään suspendoimalla uudelleen solut, jotka on pelletoitu sentrifugoimalla (pyörittämällä suurilla nopeuksilla) TRIzol-reagenssissa (Life Technologies). Muut TRIzol-versiot (kuten Ambionin TRI-reagenssi) toimivat samalla tavalla.
RNA: n kokonaiseristys: Sarjaa sentrifugointia käytetään solun eri komponenttien (proteiinit, DNA, RNA) erottamiseen kerroksiin tai faaseihin suspension sisällä. Yläosa, keltainen, koostuu rasvasta ja voidaan hävittää. Haluttu vaihe on värjätty punaiseksi, sisältää kokonais-RNA: n ja säilyy. Sen jälkeen kun fenoli-kloroformi-uutto ja sarja alkoholipestyjä on käytetty isopropanolia ja etanolia, RNA voidaan pelletoida mRNA: n eristämistä varten. Lisää RNaasi-inhibiittoreita estääksesi tätä entsyymiä hajoamasta kokonais-RNA: ta.
mRNA-uutto: On yleistä käyttää kittiä mRNA: ien eristämiseen, koska kotitekoiset laboratorioprotokollat eivät tuota suuria määriä erittäin puhdistettuja mRNA: ita. Kaupallisiin sarjoihin sisältyy Invitrogen's FastTrack 2.0 tai Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Nämä perusvaiheet ovat yhteisiä tällaisille sarjoille:
a) Sekoita pakkauksen mukana toimitettu RNaasi-inhibitioitu lyysipuskuri korkeintaan 300 mikrolitraa RNA: ta.
b) Kuumenna 5 minuuttia 65 celsiusasteessa ja jäähdytä sitten näyte heti jään päällä minuutin ajan.
c) Sekoita tämä 0,5 M natriumkloridilla ja liuota sitten sitten Oligo dT (oligodeoksitymidyylihappo) kokonaan tähän näytteeseen.
d) Sentrifugoi tämä näyte ja ota talteen supernatantti, joka pestään useita kertoja sarjoissa sitovia ja vähän suolaa sisältäviä puskureita, jotka toimitetaan sarjoissa.
e) Eluointi mRNA: ta useita kertoja, kunnes saadaan kit-määrätty tilavuus (esim. 500 mikrolitraa).
f) Saosta eluaatti saostamalla natriumasetaatilla ja etanolilla. Suspendoidaan uudelleen enintään 20 mikrolitraan dietyylipyrokarbonaatilla (DEPC) käsiteltyä vettä.
g) Säilytä -80 celsiusasteessa ja tarkista laatu ja määrä spektrofotometrillä.