Sisältö
- Kuinka geelielektroforeesi toimii
- Perus-elektroforeesimenetelmä
- Tuntemattomien fragmenttien pituuksien määrittäminen
Mikrobiologit tarvitsevat tempun, kun mitataan DNA-fragmentteja, jotka ovat paljon pienempiä kuin solut, ja sopivin on geelielektroforeesi. Tämä menetelmä perustuu siihen tosiseikkaan, että DNA-fragmentit ladataan, ja se on vaihtoehto kalliimmille menetelmille, kuten röntgenkristallografialle, joka oli vastuussa DNA: n kaksoisheeliksisen rakenteen löytämisestä.
Kuinka geelielektroforeesi toimii
Koska DNA-molekyylit ovat varautuneita, niihin vaikuttaa sähkövirta. Kun asetat ne neutraaliin geeliin ja asetat virran geelin poikki, molekyylit siirtyvät kohti positiivista elektrodia (anodi). Koska erikokoisilla DNA-molekyyleillä on sama varaus, pienemmät kulkevat nopeammin, joten tämä prosessi erottaa molekyylit vyöhykkeiksi, joita voidaan verrata tunnettujen kokoisten näytteiden kanssa.
Perus-elektroforeesimenetelmä
Geeli on yleensä valmistettu agaroosista, polysakkaridista, joka puskuriliuoksessa kuumennettaessa muodostaa puolikiinteän, hieman huokoisen geelin. Yhdessä päässä geeli muodostaa pienet syvennykset, joita kutsutaan kaivoiksi, joihin tutkija asettaa tutkittavan DNA-näytteet, joiden referenssinäytteet ovat tiedossa ja joita kutsutaan DNA-tikkeiksi. Tikkaat fragmenttien pituudet on ennalta määritetty toisella menetelmällä, kuten röntgenkristallografialla.
Kun geeli upotetaan johtavaan liuokseen ja syötetään jännitettä, fragmentit alkavat kulkeutua geelin läpi - pienemmät ensin ja suuret, hitaammat takana. Lopulta ne muodostavat itsensä koon mukaan spektrimaisiksi kaistoiksi.
Kun tämä tapahtuu, tutkija sammuttaa virran, infusoi geelin DVA: ta sitovalla väriaineella ja tutkii näytteitä ultraviolettivalossa. Käyttämällä tikkaita referenssinä tutkija voi määrittää kunkin fragmentin koon näkyvällä kaistalla. Vain nauhat ovat näkyvissä - yksittäiset DNA-fragmentit ovat liian pieniä nähdäkseen.
Tuntemattomien fragmenttien pituuksien määrittäminen
Mahdollisuudet eivät ole jokainen näytteen kaista, joka muodostuu pareista nauhalla tikkaalla, joten tutkijoiden tuntemattomien katkelmien koon määrittämiseksi piirretään yleensä kuvaaja. X-akselilla on tikkaiden kunkin nauhan kulkema etäisyys millimetreinä, kun taas y-akselilla on kunkin kaistan koko. Kun pisteet yhdistetään käyrällä, minkä tahansa kaistan koko voidaan ekstrapoloida käyrästä sen jälkeen, kun mitattu on sen kaistan kulkema etäisyys millimetreinä.