Sisältö
Gram-värjäys on differentiaalinen värjäysmenettely, joka osoittaa, mitkä bakteerit ovat gram-positiivisia tai gram-negatiivisia värjäyksen perusteella. Asetonialkoholi on yksi reagenssi, jota käytetään tässä prosessissa värierottelun aikaansaamiseksi. Gram-positiivisilla bakteereilla on paksu peptidoglykaanikerros ja värjäytyvät violetilla, kun taas gram-negatiivisilla mikro-organismeilla on vähän tai ei ollenkaan peptidoglykaanikerrosta ja ne ovat vaaleanpunaisia.
Ensisijainen tahra-kristalli violetti
Kun bakteerinäytteen objektilasi on valmistettu, näytteen värjäämiseen käytetään ensin kristalliviolettia. Tässä vaiheessa sekä gram-positiiviset että gramnegatiiviset bakteerit näyttävät purppuraisilta. Yleensä kidevioletti levitetään objektilasille 30 sekunnin ajan ennen pestään ylimääräinen tahra vedellä. Kristallioletti voi tarttua hiukan peptidoglykaanikerroksiin, joten kaikki primaaritahrat eivät pese vedellä.
Mordant-Jodi
Sitten jodia lisätään näytteeseen yhden minuutin ajan. Se toimii peitteenä, joka vahvistaa väriaineet värjäysprosessissa. Jodi suorittaa tämän toiminnon sitoutumalla kristalliviolettiin ja luomalla liukenemattoman kompleksin, joka tarttuu paljon paremmin grampositiivisissa bakteerisoluissa olevaan paksuun peptidoglykaanikerrokseen kuin pelkästään kidevioletti. Jodin lisäämisen jälkeen ei ole pesuvaihetta vedellä.
Värinpoistajaksi-Alkoholi
Joko asetonia tai etyylialkoholia voidaan käyttää värinpoistoaineena. Alkoholi liuottaa gram-negatiivisten bakteerien ulkoisissa solukalvoissa olevia lipidejä antaen kidevioletti-jodikompleksin vuotaa ohuemmasta peptidoglykaanikerroksesta. Alkoholia lisätään 10 - 20 sekunniksi; sitä kaadetaan objektilasille, kunnes kaikki jodi on pesty pois ja valuminen on väritöntä. Gram-värjäysprosessin tässä vaiheessa gramnegatiiviset bakteerit ovat värittömiä, kun taas grampositiiviset bakteerit säilyttävät silti kristallivioletin. Valmistuttuaan liukumäki on huuhdeltava vedellä värinpoistovaikutuksen lopettamiseksi.
Vastavärinä-Safraniini
Sitten lisätään safraniinia näkyvyyden ja kontrastin lisäämiseksi värittömiin gramnegatiivisiin bakteereihin. Värjäys saa nämä bakteerit vaaleanpunaisiksi mikroskoopin alla. Koska tahraa lisätään koko näytteeseen, se värjää myös grampositiivisia bakteereja, mutta kidevioletin tummempi piilottaa vaaleamman safraniininpunaisen värin. Kun objektilasi on tulvi safraniinilla noin minuutin ajan, vettä käytetään pestämään ylimääräinen tahra, joka ei kiinnittynyt bakteerisoluihin.