Sisältö
Korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) työskennellessä hyvä kalibrointi on ehdottoman välttämätöntä luotettavien ja laadukkaiden tulosten varmistamiseksi. HPLC-laitteen oikea kalibrointi alkaa sopivan kalibrointistandardin laatimisesta. Useimmissa tapauksissa kalibrointi vaatii itse asiassa sarjan standardeja, joilla kasvatetaan konsentraatiota niin kutsutun kalibrointikäyrän tuottamiseksi. Tämä on piirretty viiva ja siihen liittyvä yhtälö, joka kuvaa testattavan kemikaalin pitoisuuden ja HPLC-ilmaisimen vasteen välistä suhdetta.
Määritä kemikaali, jonka haluat testata käytettäväksi HPLC: llä ("analyytti"). Voit esimerkiksi testata virvoitusjuomien sarjan fruktoosipitoisuuden suhteen, jolloin fruktoosi olisi analyytti.
Saada määrä sopivan puhdasta analyyttikemikaalia. Normaalisti puhtauden tulisi olla yli 99% ja analyytti on ostettava hyvämaineiselta kemikaalien toimittajalta. Esimerkiksi fruktoosin tapauksessa ostaisit puhdasta fruktoosia kemikaalimyyjältä, ei ruokakaupasta.
Määritä analyytin enimmäis- ja vähimmäisarvio pitoisuudet näytteissä, jotka aiot testata HPLC: llä. Virvoitusjuomien tapauksessa tutkisit juomien etiketit ja määrittäisit testattavien juomien alhaisimman ja korkeimman fruktoosipitoisuuden. Pidä mielessä, että alkuperäinen näyte (virvoitusjuoma) voidaan laimentaa tai muuten manipuloida analyysiä valmisteltaessa (käytetystä HPLC-menetelmästä riippuen) ja siten analyytin pitoisuutta näytteissä, jotka todella injektoidaan HPLC: hen, voidaan muuttaa. On otettava huomioon näytteissä oleva analyytin konsentraatio, joka suoritetaan HPLC: llä.
Määritä liuotin, johon liuotat analyytin, kalibrointistandardien muodostamiseksi. Tämän liuottimen on kyettävä liuottamaan analyytti oikein suhteellisen laajalla pitoisuusalueella (vähintään yhtä suuri kuin näytteissä, jotka aiot testata). Samoin tämän liuottimen tulisi olla ihannetapauksessa melko samanlainen kuin "liikkuva faasi": liuotin, jota käytettiin näytteiden kuljettamiseen HPLC-instrumentin läpi.
Laske määrä analyyttiä, joka tarvitaan analyytin "varastostandardiliuoksen" valmistamiseksi. Tämä saadaan kertomalla varastostandardin vaadittu pitoisuus halutulla tilavuudella. Analyytin pitoisuuden tässä liuoksessa tulisi olla vähintään 10% korkeampi kuin korkein ennakoitu näytteen pitoisuus. Jos virvoitusjuomanäytteessä eniten odotettavissa olevaa fruktoosipitoisuutta on 8 grammaa / 100 millilitraa, niin varastostandardi voitaisiin tehdä pitoisuudeksi 10 grammaa fruktoosia / 100 millilitraa. Kohtuullinen tilavuus on 500 millilitraa, joten tarvittaisiin 8/100 ml x 500 ml = 40 grammaa fruktoosia.
Punnitaan tarvittava määrä analyyttia sopivalle tarkkuustasolle. Usein yhden tai kahden desimaalin tarkkuudella painoarvo grammoina on sopiva, mutta joillekin menetelmille voidaan tarvita enemmän tarkkuutta.
Siirretään punnittu analyytti tarvittavan tilavuuden mittapulloon ja lisätään haluttu liuotin pullon täyttömerkille. Mittapullon (esimerkiksi mittalasiin) käyttö lisää kannan standardipitoisuusarvon tarkkuutta. Varmista, että kaikki analyytti on siirretty pulloon; pese tarvittaessa osa liuottimesta.
Tulppa suljetaan ja ravistetaan tai käännetään varovasti, kunnes analyytti on liuennut kokonaan.
Tee sarja vaihtelevia laimennoksia varastostandardia siirtämällä tunnetut määrät varastostandardia mittapulloihin käyttämällä pipettejä tarkan siirron aikaansaamiseksi ja lisäämällä sitten liuotinta. Pienimmän standardipitoisuuden tulisi olla alhaisimman odotettavissa olevan analysoitavan näytteen alapuolella. Virvoitusjuomaesimerkissä, jos alin odotettu fruktoosipitoisuus näytteessä on 2 grammaa / 100 ml, silloin voitaisiin tehdä 1 gramman / 100 ml: n standardi. Tämä tehdään kymmenkertaisesti laimentamalla varastostandardia. Standardisarjan tulisi sisältää yhteensä 5 tai 6 konsentraatiota, joten lisälaimennokset standardien tuottamiseksi olisivat ehkä 3, 5 ja 8 grammaa fruktoosia / ml. Sinulla on nyt sarja vakioratkaisuja, joiden avulla voit kalibroida HPLC: n.