Sisältö
Western-blottaus on yksi yleisimmistä menetelmistä biokemiallisissa laboratorioissa. Pohjimmiltaan se erottaa proteiinit näytteestä koon mukaan, sitten testaa vasta-aineita käyttämällä määrittääkseen, onko tietty proteiini läsnä. Se on hyödyllinen paitsi tutkimuksessa myös lääketieteellisissä tai diagnostisissa laboratorioissa; Esimerkiksi sekä HIV- että Lyme-taudin kokeisiin sisältyy entsyymisidottu immunosorbenttimääritys (ELISA), jota seuraa Western blot, jos ELISA-testi on positiivinen. Suosituksestaan huolimatta Western-blottauksella on kuitenkin useita haittoja.
Nonquantitative
Klassiset Western-blotit ovat ei-kvantitatiivisia. Toisin sanoen, vaikka he voivat kertoa tutkijoille, onko tietty proteiini läsnä, ne eivät tee mahdolliseksi määrittää, kuinka suuri osa proteiinista on läsnä. Jotkut biotekniikkayritykset myyvät nyt sarjoja, joiden avulla tutkijat tai laboratorioteknikot voivat määrittää läsnä olevan proteiinimäärän vakiokäyrällä - mutta tämä toimii vain, jos saatavana on puhtaita näytteitä samasta proteiinista. Lisäksi proteiinin molekyylipaino voidaan estimoida vain Western-blottauksella, sen sijaan, että se määritettäisiin tarkasti kuten massaspektrometrialla.
vasta-aineita
Western blot voidaan suorittaa vain, jos mielenkiinnon kohteena olevaa proteiinia vastaan on saatavana primaarisia vasta-aineita. Biotekniikkayrityksiltä on saatavana vasta-aineita monille erilaisille proteiineille, mutta ne eivät ole halpoja; jos primaarisia vasta-aineita ei ole saatavana tietylle proteiinille, ei ole mahdollista suorittaa Western blot -hakua etsiessään kyseistä proteiinia. Lisäksi tutkijat voivat haluta selvittää, onko proteiini muutettu jollakin tavalla - jos se on fosforyloitu (esimerkiksi siihen on kiinnitetty fosfaattiryhmä) - ja Western blot -tekniikalla he tarvitsevat modifioituneelle vasta-aineita proteiinia.
koulutus
Voi olla haastavaa suorittaa Western blot -menetelmä oikein ja saada hyviä tuloksia, joten henkilöstön on oltava hyvin koulutettua.Tässä, kuten monessa muussakin, kokemus on ehkä paras ohjaaja; jopa kokeneelle teknikolle Western-blotti on kuitenkin aikaa vievä. Esimerkiksi kokeen geelielektroforeesiosa kestää tyypillisesti yhdestä kahteen tuntia. Muita tehtäviä voidaan luonnollisesti suorittaa geelin ollessa käynnissä, mutta kokeilu vie vielä paljon aikaa tulosten saamiseen.
Muut rajoitukset
Vasta-aineilla voi joskus esiintyä jonkin verran kohdistamatonta sitoutumista, mikä voi johtaa huonompiin tuloksiin. Lisäksi Western-blottauksella käytät vasta-ainetta tiettyä proteiinia vastaan, joten tulokset kertovat vain, jos kyseistä proteiinia oli läsnä. Korkean resoluution massaspektrometria sen sijaan paljastaa kaikki näytteessä olevat proteiinit, ja toisin kuin klassinen Western-blottaus, se on kvantitatiivinen. On tietenkin tärkeää muistaa, että massaspektrometria on paljon kalliimpaa ja myös teknisesti haastavampaa käyttää verrattuna Western-blottaukseen.