Sisältö
Kun olet suorittanut DNA-näytteet agaroosigeelillä ja ottanut kuvan, voit tallentaa kuvan myöhempää käyttöä varten, jolloin voit analysoida tulokset ja tulkita niitä. Millaiset asiat etsit, riippuvat kokeilusi luonteesta. Jos esimerkiksi teet sormenjälkeä DNA: lla, haluat vertailla kahden näytteen DNA-kappaleiden kokoa - epäillyn ja ehkä rikospaikan näytteestä. Jos työskentelet bakteerien aiheuttamien plasmidien kanssa, sen sijaan sinun on ehkä varmistettava, että plasmidi sisältää insertin. Näin ollen kuinka tulkitset geeliä, riippuu osittain kokeesta, jonka teit. Siitä huolimatta on joitain yleisiä sääntöjä, joita voit soveltaa.
Mittaa kuvan yläreunasta etäisyys jokaiseen vyöhykkeeseen geelisi "standardi" -kaistalla (eli tikkaat). Standardikaista sisältää DNA-paloja, joiden koko on jo tiedossa, joten sinun pitäisi jo tietää kunkin koko ennen kokeilun aloittamista. Mittaa myös vyöhykkeiden kulkema etäisyys jokaisessa näytekaistassa.
Jaa etäisyys kunkin standardin ja kunkin näytteen juovan välillä etäisyydellä geelin pohjaan. Tulosta kutsutaan suhteelliseksi liikkuvuudeksi. Voit käyttää laskentataulukko-ohjelmaa laskutoimituksen tekemiseen puolestasi, jos se nopeuttaa tätä vaihetta.
Kirjoita kunkin standardin suhteellinen liikkuvuus ja koko laskentataulukko-ohjelmaan ja käytä sitten taulukkolaskentaohjelmien piirtotyökalulla kuvaajaa näistä tiedoista suhteellisella liikkuvuudella x-akselilla ja koon y kohdalla.
Sovita viiva kuvaajaan epälineaarisella regressiolla. Katso laskentataulukko-ohjelmien ohjeosasta, jos sinun on tiedettävä, miten tämä tehdään. Sinun pitäisi saada aikaan yhtälö, ehkä yksi seuraavan kaltainen:
y = (0,3) x ^ -2,5
Huomaa, että x on tässä suhteellinen liikkuvuus, kun taas y on koko. Huomaa myös, että yhtälölläsi voi olla täysin erilaisia lukumääriä eksponentille ja kertoimelle - tämä yhtälö on vain annettu hypoteettisena esimerkkinä.
Ota näytteiden vyöhykkeiden suhteellinen liikkuvuus ja kytke se x: na laskeaksesi näytevyöhykkeiden DNA-kappaleiden koon.
Oletetaan, että laskentataulukko-ohjelman johdettu yhtälö oli todellakin y = (0,3) x ^ -2,5, ja tietyn näytekaistan suhteellinen liikkuvuus oli 0,68. Korvaamalla yhtälöön 0,68, löydät seuraavan:
y = (0,3) (0,68) ^ - 2,5
Laskimen avulla nostat 0,68 arvoon -2,5 ja löydät seuraavan:
y = (0,3) (2,62)
y = 0,786
joka olisi tällöin DNA: n arvioitu koko kilobaasina yhdessä näytteesi kaistaleessa.
plasmidit
Huomaa, että sinun on ehkä käytettävä tämän osan ohjeita. Agaroosigeelielektroforeesia käytetään usein varmistamaan, että plasmidi sisältää annetun insertin. Jos et työskentele plasmidien kanssa, voit ohittaa tämän osan. Voit kuitenkin noudattaa näitä ohjeita.
Huomaa, että jos työskentelet leikkaamattomien tai piilotettujen plasmidien kanssa, et voi arvioida kokoa yllä olevassa osassa 1 esitetyllä tavalla. Että koska leikkaamattomat ja nikkelöidyt plasmidit siirtyvät eri nopeudella lineaarisesta DNA: sta.
Vertaa kaistojen lukumäärää jokaisella kaistalla. Muista, että restriktioentsyymi leikkaa DNA: ta paikoissa, joissa esiintyy tietty sekvenssi, jota kutsutaan restriktiopaikaksi. Jos näytettä käsiteltiin kahdella restriktioentsyymillä, nauhan insertille ja nauhan lopulle plasmidista tulisi olla molemmat. Eli insertin reunustavat kaksi restriktiopaikkaa, kukin erilaiselle entsyymille, joten leikkaukset molemmissa näissä kohdissa vapauttavat insertin plasmidista. Vain yhdessä paikassa oleva leikkaus sitä vastoin muuntaa plasmidin lineaariseksi DNA: ksi. Näytteessä, joka on leikattu ilman restriktioentsyymejä tai yhdellä restriktioentsyymillä, tulisi sitten olla yksi kaista, kun taas kahdella restriktioentsyymillä leikatussa näytteessä tulisi olla kaksi kaistaa.
Varo kaistoja, jotka on luonut nikkelöity plasmidi-DNA. Nykitty plasmidi leikkaa vain yhden juosteen, joten se kulkeutuu hitaammin kuin leikattu plasmidi. Leikatut plasmidit vuorostaan muuttuvat hitaammin kuin leikkaamaton DNA.
Arvioi insertin koko kohdassa 1 kuvatulla tavalla ja määritä, vastaako se odotuksiasi (jotka vaihtelevat kokeesta riippuen).