Sisältö
DNA-
Deoksiribonukleiinihappo ja proteiinit. DNA on järjestetty yksiköiksi, joita kutsutaan geeneiksi, joista kukin koodaa tiettyä RNA- tai proteiinisekvenssiä. Geenejä tutkitaan oppimaan biologisesta rakenteesta ja toiminnasta, evoluutiosta, taudeista ja monista muista elävien järjestelmien näkökohdista. Geenien tutkimiseksi yksityiskohtaisesti, DNA on eristettävä ja puhdistettava mielenkiinnon kohteena olevista soluista.
DNA: n uutto
Vaikka yhden solun DNA voidaan erottaa ja tutkia, se ei riitä näkemään paljaalla silmällä. Saadaksesi riittävä määrä kelausta varten, sitä enemmän soluja on työskenneltävä paremman kanssa (useita miljoonia).
Tarkat protokollat vaihtelevat huomattavasti tiettyjen näytteiden ainutlaatuisten ominaisuuksien huomioon ottamiseksi, mutta yleisiä vaiheita ovat homogenointi, hajotus, hajotus, erottaminen ja kerääminen. Menetelmä suoritetaan parhaiten pienessä (näytteen koosta riippuen) lasi- tai muoviputkessa.
Näyte sekoitetaan tai jauhetaan yleensä solujen erottamiseksi perusteellisesti toisistaan. Tämä tekee solun aineosista helpommin seuraaville reagensseille. Sitten homogenaattiin lisätään pesuainetta tai entsyymejä solukalvojen (ja ydinkalvojen, jos solut ovat eukaryoottisia) hajottamiseksi DNA: n vapauttamiseksi. Tässä vaiheessa DNA: ta ympäröivät proteiinit, lipidit, hiilihydraatit --- kaikki muu, mitä soluissa oli.
Lisäentsymaattinen pilkkominen voi olla tarpeen proteiinien hajottamiseksi, jotta ne eivät sitoutu DNA: han ja häiritsevät sen keräämistä. DNA erotetaan solun muusta sisällöstä lisäämällä kylmää, puhdasta, etyyli- tai isopropyylialkoholia. DNA ei liukene näihin alkoholiin, joten se tiivistyy yrittäessään minimoida sen kosketuksen alkoholiin. Sitten kondensoituneet DNA: t kerätään, yleensä sentrifugoimalla - tai kelaamalla.
DNA-kelaus
DNA-keräys spoolilla on tehokasta, kun uuttoproseduurista saadaan suuri määrä DNA: ta. Se on myös erinomainen demonstraatiomenetelmä, koska vaikuttava ryppy puhdasta DNA: ta on selvästi näkyvissä.
DNA: n kelaamiseksi erotusvaihe on suoritettava huolellisesti. Jos se ei ollut osa aikaisemmin lisättyä hajotusreagenssiseosta, liuok- seen on lisättävä väkevää suolaliuosta (natriumkloridi) ennen alkoholin lisäysvaihetta. Kylmä alkoholi kaadetaan hitaasti koeputken puolelle, jotta muodostuu kerros vesiliuoksen päälle, sekoittamisen välttämiseksi. Jos alkoholia tehdään oikein, se muodostaa oman kerroksensa suolaisen kerroksen päälle. Sitten tulee kelaaminen.
DNA: n keräämiseksi suolakerroksesta asetetaan varovasti lasisekoitussauva alkoholikerroksen läpi, kunnes se koskettaa putken pohjaa. Pyöritä sauvaa hitaasti sormien välillä tarkkailemalla kahden kerroksen välistä rajapintaa. Jos DNA: ta on läsnä riittävästi, se tarttuu yhteen kerrosten välisessä rajapinnassa maitomaisen läpikuultavan massan muodostamiseksi. Pyöritä sauvaa käärittämään DNA sen ympärille (se on puolausosa) ja vedä se ulos putkesta. DNA voidaan siirtää toiseen puhtaan alkoholin putkeen varastointia tai lisäanalyysejä varten.