Sisältö
- DNA-kloonaus: määritelmä ja prosessin yleiskuvaus
- Plasmidivektorimenetelmä
- PCR (polymeraasiketjureaktio) -menetelmä
- Plasmidivektorin ja PCR-DNA-kloonausmenetelmien käyttö yhdessä
- Esimerkkejä DNA-kloonauksesta bioteknologiaan
- Esimerkkejä DNA-kloonauksesta tutkimusta varten
- Esimerkkejä DNA-kloonauksesta geeniterapiaa varten
On mahdollista kloonata kokonaisia organismeja, kuten lampaita Dolly, mutta DNA-kloonaus on erilainen. Se käyttää molekyylibiologian tekniikoita identtiset kopiot DNA-sekvenssejä tai yksittäisiä geenejä.
Geeniteknisillä menetelmillä DNA-geenikoodin segmentit tunnistetaan ja eristetään. DNA-kloonaus kopioi sitten segmenttien nukleiinihapposekvenssit.
Tuloksena saatuja identtisiä kopioita voidaan käyttää jatkotutkimukseen tai biotekniikan sovelluksiin. Usein kopioitu geeni koodaa proteiinia, joka voi olla osa lääketieteellisiä hoitoja. DNA - tekniikka, mukaan lukien DNA-kloonaus tukee ymmärrystä siitä, kuinka geenit toimivat ja miten ihmisen geneettinen koodi vaikuttaa kehon toimintaan.
DNA-kloonaus: määritelmä ja prosessin yleiskuvaus
DNA-kloonaus on molekyylibiologinen prosessi, jolla tehdään identtisiä kopioita kromosomeissa sijaitsevista DNA-segmenteistä, jotka sisältävät edistyneiden organismien geneettisen koodin.
Prosessi tuottaa suuria määriä kohde-DNA-sekvenssit. DNA-kloonauksen tarkoituksena on tuottaa kohde-DNA-sekvenssit itse tai tuottaa kohdesekvensseihin koodatut proteiinit.
Kahta DNA-kloonauksessa käytettyä menetelmää kutsutaan plasmidivektori ja polymeraasiketjureaktio (PCR). vuonna plasmidivektori menetelmällä DNA-juosteet leikataan käyttämällä restriktioentsyymit DNA-fragmenttien tuottamiseksi, ja tuloksena olevat segmentit insertoidaan kloonausvektoreihin, joita kutsutaan plasmideiksi jatkamiseksi. Plasmidit sijoitetaan bakteerisoluihin, jotka sitten tuottavat DNA-kopioita tai koodattuja proteiineja.
vuonna PCR-menetelmä, duplikoitavien DNA-juosteiden segmentti on merkitty entsyymeillä, joita kutsutaan alukkeita. Polymeraasientsyymi tekee kopioita DNA-juosteen merkitystä osasta. Tämä menetelmä ei käytä restriktioentsyymejä ja se voi tuottaa kloonattua DNA: ta pienistä näytteistä. Joskus kahta DNA-tekniikan menetelmää käytetään yhdessä sisällyttämään molempien parhaat ominaisuudet kokonaisreaktioon.
Plasmidivektorimenetelmä
Menetelmän vektori viittaa plasmidiin, jota käytetään pitämään kloonattavaa kohde-DNA-segmenttiä. Plasmidit ovat pieniä pyöreitä säikeitä ei-kromosomaalinen DNA löytyy monista organismeista, mukaan lukien bakteerit ja virukset.
Bakteeriplasmidit ovat vektoria, jota käytetään kohde-DNA-segmentin insertoimiseen bakteerisoluihin jatkamista varten.
Kohde-DNA: n valitseminen ja eristäminen: Ennen kuin DNA: n kloonausprosessi voi alkaa, DNA-sekvenssit on tunnistettava, erityisesti DNA-segmenttien alku ja pää.
Tällaiset DNA-sekvenssit voidaan löytää käyttämällä olemassa olevaa kloonattua DNA: ta tunnettujen sekvenssien kanssa tai tutkimalla kohde-DNA-sekvenssin tuottamaa proteiinia. Kun sekvenssi on tiedossa, voidaan käyttää vastaavia restriktioentsyymejä.
Kohde-DNA: n leikkaaminen restriktioentsyymeillä: Restriktioentsyymit valitaan etsimään DNA-koodia kohdesekvenssien alussa ja lopussa.
Kun restriktioentsyymit löytävät erityisen koodatun emäsparien sekvenssin, jota kutsutaan restriktiopaikoiksi, ne kiinnittyvät DNA: hon siinä kohdassa ja kiertävät itsensä DNA-molekyylin ympärille katkaiseen juosteen. Kohdesekvenssin sisältävät leikatut DNA-segmentit ovat nyt saatavissa monistamiseen.
Plasmidivektorin valitseminen ja kohde-DNA: n insertointi: Sopiva plasmidi sisältää mieluiten samat DNA: ta koodaavat sekvenssit kuin DNA-juoste, josta kohde-DNA leikattiin. Plasmidin pyöreä DNA-juoste leikataan samoilla restriktioentsyymeillä, joita käytettiin kohde-DNA: n leikkaamiseen.
DNA-ligaasientsyymi Käytetään edistämään DNA-segmentin linkittämistä, ja kohde-DNA-segmentin päät yhdistyvät plasmidi-DNA: n leikattuihin päihin. Kohde-DNA muodostaa nyt osan pyöreästä plasmidi-DNA-juosteesta.
Plasmidin lisääminen bakteerisoluun: Kun plasmidi sisältää kloonattavan DNA-sekvenssin, todellinen kloonaus voi tapahtua käyttämällä menetelmää, jota kutsutaan bakteerimuutos. Plasmidit insertoidaan bakteerisoluun, kuten E. coli, ja solut, joissa on uudet DNA-segmentit, alkavat tuottaa kopioita ja vastaavia proteiineja.
Bakteerimuunnoksessa isäntäsoluja ja plasmideja inkuboidaan yhdessä ruumiinlämpötilassa noin 12 tuntia. Solut absorboivat joitain plasmideista ja käsittelevät niitä omalla plasmidi-DNA: naan.
Kloonatun DNA: n ja proteiinien sato: Useimmissa DNA-kloonaukseen käytetyissä plasmideissa on antibioottiresistenssigeenit sisällytetty heidän DNA: hon. Kun bakteerisolut imevät uudet plasmidit, niistä tulee resistenttejä antibiooteille.
Kun viljelmää käsitellään antibiooteilla, vain ne solut, jotka ovat absorboineet uudet plasmidit, selviävät. Tuloksena on puhdas bakteerisolujen viljely kloonatulla DNA: lla. Tämä DNA voidaan sitten kerätä tai tuottaa vastaava proteiini.
PCR (polymeraasiketjureaktio) -menetelmä
PCR-menetelmä on yksinkertaisempi ja kopioi olemassa oleva DNA paikalleen. Se ei vaadi leikkaamista restriktioentsyymeillä tai plasmidi-DNA-sekvenssien lisäämistä. Tämä tekee siitä erityisen sopivan DNA-näytteiden kloonaamiseen rajoitetulla määrällä DNA-juosteita. Vaikka menetelmä voi kloonata DNA: ta, sitä ei voida käyttää vastaavan proteiinin tuottamiseen.
DNA-juosteiden kelaaminen: Kromosomissa oleva DNA on tiukasti käämitty kaksoiskierrerakenteeseen. Kuumennetaan DNA 96 celsiusasteeseen prosessissa, jota kutsutaan denaturointi saa DNA-molekyylin kiertymään ja jakautumaan kahteen juosteeseen. Tämä erottaminen on tarpeen, koska vain yksi DNA-juoste voidaan kloonata kerrallaan.
Alukkeiden valinta: Kuten plasmidivektorin DNA-kloonaamisessa, kloonattavat DNA-sekvenssit on tunnistettava kiinnittämällä erityistä huomiota DNA-segmenttien alkuihin ja päihin. Alukkeet ovat entsyymejä, jotka kiinnittyvät tiettyihin DNA-koodisekvensseihin, ja ne on valittava kohde-DNA-segmenttien merkitsemiseksi. Oikeat alukkeet kiinnittyvät DNA-molekyylisekvensseihin merkitsemään kohdesegmenttien alkuja ja päätä.
Reaktion hehkuttaminen alukkeiden sitomiseksi: Reaktion jäähdyttämistä noin 55 ° C: seen hehkutus. Kun reaktio jäähtyy, alukkeet aktivoituvat ja kiinnittyvät DNA-juosteeseen kohde-DNA-segmentin molemmissa päissä. Alukkeet toimivat vain markkereina, eikä DNA-juostetta tarvitse leikata.
Tuottaa samanlaisia kopioita kohde-DNA-segmentistä: Prosessissa, jota kutsutaan laajentaminen, lämpöherkkä TAQ-polymeraasientsyymi lisätään reaktioon. Sitten reaktio kuumennetaan 72 celsiusasteeseen aktivoimalla entsyymi. Aktiivinen DNA-polymeraasientsyymi sitoutuu alukkeisiin ja kopioi niiden välillä olevan DNA-sekvenssin. Alkuperäinen DNA-sekvensointi- ja kloonausprosessi on valmis.
Kloonatun DNA: n saannon lisääminen: Alkuperäinen hehkutus- ja jatkeprosessi luo suhteellisen vähän kopioita käytettävissä olevista DNA-juostesegmenteistä. Saannon lisäämiseksi lisäämällä DNA-replikaatiota, reaktio jäähdytetään uudelleen alukkeiden uudelleenaktivoimiseksi ja annetaan niiden sitoutua muihin DNA-juosteisiin.
Sitten reaktion lämmittäminen uudelleen aktivoi polymeraasi-entsyymin uudelleen ja saadaan lisää kopioita. Tämä jakso voidaan toistaa 25 - 30 kertaa.
Plasmidivektorin ja PCR-DNA-kloonausmenetelmien käyttö yhdessä
Plasmidivektorimenetelmä perustuu riittävään DNA: n alkutuotantoon leikata ja insertoida plasmideihin. Liian pieni alkuperäinen DNA johtaa vähemmän plasmideja ja hitaan kloonatun DNA-tuotannon alkamisen.
PCR-menetelmä voi tuottaa suuren määrän DNA: ta muutamasta alkuperäisestä DNA-juosteesta, mutta koska DNA: ta ei implantoida bakteerisoluun, proteiinintuotanto ei ole mahdollista.
Kloonattavien DNA-fragmenttien koodaaman proteiinin tuottamiseksi pienestä alkuperäisestä DNA-näytteestä voidaan käyttää kahta menetelmää yhdessä, ja täydentävät toisiaan. Ensin PCR-menetelmää käytetään pienen näytteen DNA: n kloonaamiseen ja monien kopioiden tuottamiseen.
Sitten PCR-tuotteita käytetään plasmidivektorimenetelmän kanssa tuotetun DNA: n implantoimiseksi bakteerisoluihin, jotka tuottavat halutun proteiinin.
Esimerkkejä DNA-kloonauksesta bioteknologiaan
Molekyylibiologia käyttää geenikloonausta ja DNA-replikaatiota lääketieteellisiin ja kaupallisiin tarkoituksiin. Kloonatulla DNA-sekvenssillä varustettuja bakteereja käytetään lääkkeiden tuottamiseen ja aineiden korvaamiseen, joita geneettisissä häiriöissä ihmiset eivät pysty itse tuottamaan.
Tyypillisiä käyttötarkoituksia ovat:
Bioteknologia käyttää myös geenikloonausta maataloudessa kasvien ja eläinten uusien ominaisuuksien luomiseksi tai olemassa olevien ominaisuuksien parantamiseksi. Kun enemmän geenejä kloonataan, mahdollisten käyttötarkoitusten määrä kasvaa räjähdysmäisesti.
Esimerkkejä DNA-kloonauksesta tutkimusta varten
DNA-molekyylit muodostavat pienen osan materiaalista elävässä solussa, ja monien geenien vaikutuksia on vaikea eristää. DNA-kloonausmenetelmät toimittavat suuria määriä spesifistä DNA-sekvenssiä tutkimusta varten, ja DNA tuottaa proteiineja samalla tavalla kuin alkuperäisessä solussa. DNA-kloonaus tekee mahdolliseksi tutkia tätä operaatiota erilaisille geeneille erikseen.
Tyypilliseen tutkimukseen ja DNA-tekniikan sovelluksiin sisältyy seuraavien tutkimusten tekeminen:
Kun kloonataan enemmän DNA-sekvenssejä, on helpompaa löytää ja kloonata lisäsekvenssejä. Olemassa olevia kloonattuja DNA-segmenttejä voidaan käyttää määrittämään, vastaako uusi segmentti vanhaa ja mitkä osat ovat erilaisia. Kohde-DNA-sekvenssin tunnistaminen on tällöin nopeampaa ja tarkempaa.
Esimerkkejä DNA-kloonauksesta geeniterapiaa varten
Sisään geeniterapia, kloonattu geeni esitetään sen organismin soluille, jonka luonnollinen geeni on vaurioitunut. Elintärkeä geeni, joka tuottaa tietyn organismin toimintaan tarvittavaa proteiinia, voisi olla mutatoitunut, muuttunut säteilyllä tai vaikuttaa viruksiin.
Kun geeni ei toimi kunnolla, tärkeä aine puuttuu solusta. Geeniterapia yrittää korvata geeni kloonatulla versiolla, joka tuottaa vaaditun aineen.
Geeniterapia on edelleen kokeellista, ja harvat potilaat ovat parantuneet tekniikkaa käyttämällä. Ongelmat liittyvät sairaudesta vastuussa olevan yhden geenin tunnistamiseen ja monien geenikopioiden toimittamiseen oikeisiin soluihin. Kun DNA-kloonaus on yleistynyt, geeniterapiaa on sovellettu monissa erityistilanteissa.
Viimeaikaiset onnistuneet sovellukset ovat sisältäneet:
Geeniterapia on yksi lupaavimmista DNA-kloonauksen sovelluksista, mutta muut uudet käytöt todennäköisesti lisääntyvät, kun tutkitaan lisää DNA-sekvenssejä ja niiden toiminta määritetään. DNA-kloonaus toimittaa geenitekniikan raaka-aineen tarvittavina määrinä.
Kun geenien rooli tunnetaan ja niiden asianmukainen toiminta voidaan varmistaa korvaamalla vialliset geenit, monia kroonisia sairauksia ja jopa syöpää voidaan hyökätä ja hoitaa geneettisellä tasolla käyttämällä DNA-tekniikkaa.
Samankaltaista sisältöä: