Sisältö
- Elektroforeesilla on rajoitettu näytteen analyysi
- Elektroforeesimittaukset eivät ole tarkkoja
- Vaaditaan olennainen aloitusnäyte
- Vain tietyt molekyylit voidaan visualisoida
- Elektroforeesi on alhaista suorituskykyä
Geelielektroforeesi on tekniikka, jossa biologiset molekyylit erotetaan toisistaan ja tunnistetaan biologisessa tutkimuksessa tai lääketieteellisessä diagnostiikassa. Näiden tekniikoiden kehittämisen jälkeen 1970-luvulla nämä tekniikat ovat olleet korvaamattomia tunnistettaessa tutkimuksen kohteena olevia geenejä (DNA) ja geenituotteita (RNA ja proteiini). Viime vuosina on syntynyt uudempia tekniikoita, jotka antavat entistä tarkemman ja yksityiskohtaisemman kuvan elävien järjestelmien tapahtumista. Vaikka nämä eivät ole korvanneet elektroforeesitekniikoita ja edistyneet manipulaatiot voivat laajentaa tekniikan kannattavuutta, on tärkeää ymmärtää, mitä geelielektroforeesi voi ja ei pysty.
Elektroforeesilla on rajoitettu näytteen analyysi
Elektroforeesi on spesifinen kudokselle, josta olet valinnut näytteen. Esimerkiksi, jos suoritat Southern-blotin (eräänlainen elektroforeesi) posketyynyllä, tarkastelet geenejä posken epiteelisoluista ja muualta kehostasi. Toisinaan siitä voi olla hyötyä, mutta tutkijoita kiinnostavat usein laajemmat vaikutukset.
Tekniikat, kuten in situ -hybridisaatio (ISH), voivat ottaa osan kudosta ja analysoida geeniekspressiota näytteen jokaisella pienellä alueella.Siksi tutkijat voivat tarkastella kaikkia näytteessä olevia aivoalueita ISH: lla, kun taas elektroforeesitekniikat voivat tarkastella vain muutamia alueita kerrallaan.
Elektroforeesimittaukset eivät ole tarkkoja
Geelielektroforeesi voi erottaa tehokkaasti samanlaiset proteiinit, joilla on eri paino (tämä on tekniikka, jota kutsutaan Western blottaukseksi). Se voi erottaa ne tarkemmin tekniikalla, joka tunnetaan nimellä 2d-elektroforeesi; tämä on yleistä proteomiikassa.
Valitettavasti kaikki tällä tekniikalla tehdyt mittaukset ovat parhaimmillaan puolikvantitatiivisia. Proteiinien tarkan massan (painon) saamiseksi on käytettävä massaspektroskopiaa sen jälkeen, kun proteiini on puhdistettu elektroforeesilla. Lisäksi eri molekyylien suhteellisten määrien vertailu perustuu geelin eri pisteiden kaistatiheyteen (tummuuteen). Tässä menetelmässä on jonkin verran virheitä, ja näytteet suoritetaan yleensä useita kertoja puhtaiden tulosten saamiseksi.
Vaaditaan olennainen aloitusnäyte
Elektroforeesi on tekniikka erilaisten biomolekyylien eristämiseksi ja visuaaliseksi tunnistamiseksi. Tämä tehdään johtamalla sähkövirta geelin läpi eripai- koisilla varautuneilla molekyyleillä. Jos kiinnostunut molekyyli ei ole tarpeeksi yleinen, sen kaista on käytännössä näkymätön ja vaikea mitata.
DNA ja RNA voidaan monistaa jonkin verran ennen elektroforeesin suorittamista, mutta tätä ei ole käytännöllistä tehdä proteiineilla. Siksi näiden määritysten suorittamiseen tarvitaan suuri kudosnäyte. Tämä voi rajoittaa tekniikan hyödyllisyyttä, erityisesti lääketieteellisissä analyyseissä. On käytännössä mahdotonta suorittaa elektroforeesia näytteistä yhdestä solusta; virtaussytometriaa ja immunohistokemiaa käytetään yleisemmin proteiinien solukohtaisen ekspression arvioimiseksi. PCR-niminen tekniikka on erinomainen pienten RNA-määrien tarkkaan mittaamiseen.
Vain tietyt molekyylit voidaan visualisoida
Elektroforeesi on erinomainen erottamaan ja tunnistamaan keskisuurista tai suurista biomolekyyleistä. Monet molekyylit, joita tutkijat haluavat tarkastella, ovat kuitenkin pienempiä; pieniä hormoneja, välittäjäaineita ja ioneja ei voida mitata elektroforeesilla. Tämä johtuu kahdesta syystä: ne eivät reagoi kunnolla elektroforeesivalmisteen kanssa (yleensä tekniikka nimeltään SDS PAGE), ja vaikka ne tekisivätkin, ne ovat liian pieniä erottuakseen kunnolla ja johtaisivat geelin pohjan ulos. Nämä molekyylit mitataan sen sijaan tekniikoilla, kuten RIAA: t (radioimmunomääritykset) ja ELISA: t (entsyymisidottu immunosorbenttimääritys).
Elektroforeesi on alhaista suorituskykyä
Geelielektroforeesi on yleensä alhainen suorituskyky, mikä tarkoittaa, että se ei tuota dataa erityisen nopeasti. Kontrastielektroforeesi, jossa voit tarkastella pieniä kourallisia RNA-molekyylejä kerrallaan PCR: llä (polymeraasiketjureaktio), jolla voidaan samanaikaisesti arvioida tuhansia näytteitä. Samoin virtaussytometria voi ottaa mittauksia tuhansista yksittäisistä soluista ja tehdä monimutkaisia korrelaatioita, kun taas elektroforeesi tarkastelee soluja massiivisesti eikä voi tehdä niin hienoja erittelyjä. PCR ja virtaussytometria edustavat massiivisesti rinnakkaisia ja sarjaprosesseja, ja molemmat ylittävät huomattavasti elektroforeesin kyvyn tuottaa tutkimustietoa.