Sisältö
Geelielektroforeesissa DNA- tai proteiininäytteet erotetaan - tyypillisesti koon perusteella - soveltamalla sähkökenttää, joka aiheuttaa niiden siirtymisen geelin läpi. Geelielektroforeesin käyttö on rutiinia biolääketieteellisissä tutkimuslaboratorioissa ja sitä käytetään vastaamaan moniin erilaisiin kysymyksiin, joten tulosten analysoimiseksi ei todellakaan ole universaalia tapaa.
Eri tekniikoihin, kuten esimerkiksi Western-blottaukseen, Northern-blottaukseen ja Southern-blottaukseen, sisältyy kaikki geelielektroforeesi.
Jos teet DNA-näytteiden agaroosigeelielektroforeesia, yleisimmänä menetelmänä, sinun on tyypillisesti tehtävä vähintään kaksi asiaa: 1) erota leikkaamattomat plasmidit insertteistä, nikkelöityistä plasmideista ja leikattuista plasmideista ja 2) arvioida erilaisten DNA-fragmentit standardikäyrällä Excel tai laskin.
Heres miten se toimii.
Tarkista lab-muistikirjasta, mitkä näytteet on ladattu mihin kaistoihin. Kun olet ladannut geelin kaivoja, sinun olisi pitänyt merkitä kunkin kaistan / näytteen tunnistetiedot.
Määritä, mikä kaista sisältää DNA-standardien "tikkaat". Nämä ovat fragmentteja, joiden pituus on tiedossa; niiden siirtymäetäisyyttä voidaan käyttää määrittämään näytepalasten koko käyttämällä vakiokäyrää Excel tai muuta laskuria.
Mittaa viivaimen avulla kuvan etäisyys kaivoista jäljitysväriin, joka on kulkenut pidemmälle kuin mikään DNA-vyöhyke (toisin sanoen se on geelin alareunassa). Tallenna tämä numero - käyttämäsi yksiköt eivät ole tärkeitä.
Mittaa kuvan etäisyys kaivoista kuhunkin "tikkaiden" nauhaan, jaa sitten etäisyys seurantavärinauhan kuljettamalla etäisyydellä. Tämä laskelma antaa sinulle kunkin kaistan suhteellisen liikkuvuuden.
Esimerkki: Oletetaan, että jäljitysvärinauha kulki 6 tuumaa ja meillä on kolme kaistaa, jotka kulkivat 5, 4,5 ja 3,5 tuumaa.
Mikä on heidän suhteellinen liikkuvuutensa? Vastaus: Jaamme 5, 4.5 ja 3.5 6: lla saadaksesi suhteelliset liikkuvuudet 0,833, 0,75 ja 0,5833.
Kirjoita laskentataulukko-ohjelmaan (Excel tai muu vastaava käyttämäsi ohjelma) suhteelliset liikkuvuudet sekä tikkaiden kunkin fragmentin koko kilobasoina.
Valmistaja antaa sinulle toimittamien tikkaiden kunkin fragmentin koon, joten sinulla pitäisi jo olla nämä tiedot.
Piirrä tiedot suhteellisella liikkuvuudella x: llä ja koko kiloemäärillä y: llä.
Asenna yhtälö tietoihin taulukkolaskentaohjelman Trendline-toiminnon avulla. Tämän yhtälön tulisi olla tehoyhtälö (esim. X ^ -2) ja sen tulisi sopia dataan suhteellisen hyvin (R-kerroin vähintään 0,9). Tämä luo käyrän ja vakiokäyrän Excel.
Katso näytteitäsi vastaavat bändit.
Muista, että pienemmät DNA-fragmentit kulkevat kauempana geelin läpi kuin suuret DNA-fragmentit, joten lähinnä jäljitysväriä ovat pienimmät. Huomaa kuitenkin, että jos plasmidi (pyöreä) DNA on leikkaamaton, siitä tulee "superkelautunutta" tai kiertynyttä kuin puhelinjohtoa, mikä todella aiheuttaa sen liikkumisen kauemmas kuin samankokoinen lineaarinen DNA.
Samoin "katkaistu" plasmidi, joka on leikattu puutteellisesti, kulkee a lyhyempi etäisyys kuin samankokoinen lineaarinen DNA. Näin ollen et voi arvioida leikkaamattomien plasmidien koko geelistäsi.
Sovita kunkin kaistan kaistat kyseiselle kaistalle lataamasi näytteen tunnisteella ja määritä, onko näkemäsi se mitä odotit. Tämä riippuu kokeilusi luonteesta.
Yleensä kuitenkin, jos hajotat inserttiplasmidin kahdella restriktioentsyymillä, luulet insertin vapautuvan plasmidista.
Koska se on paljon pienempi kuin plasmidi, saatat odottaa näkevän siinä kaistassa kaksi kaistaa, yhden lähellä yläosaa ja toisen alaosan alapuolella. Plasmidin, joka on leikattu vain yhdellä restriktioentsyymillä, tulisi muodostaa vain yksi kaista, joka kulkee vähän kauempana kuin kahdella restriktioentsyymillä leikattu plasmidi, mutta ei missään määrin kuin insertti.
Mittaa etäisyys kaivoista leikattuun plasmidiin ja aseta nauhat viivaimella. Jaa nämä numerot jäljitysvärin kuljettamalla etäisyydellä inserttien ja leikattujen plasmidien suhteellisen liikkuvuuden löytämiseksi.
Kytke inserttien ja leikattujen plasmidien suhteellinen liikkuvuus laskentataulukko-ohjelmasi sinulle laskettuun yhtälöön. Tämän laskelman pitäisi antaa sinulle arvio näiden plasmidien koosta.