Sisältö
- Rajoittavat entsyymit ja rajoitussivustot
- Oikea suunta
- Sticky Endejen ligatointi vaatii vähemmän DNA: ta
- Eri entsyymit voivat antaa saman tahmean lopun
Molekulaarinen kloonaus on yleinen biotekniikan menetelmä, joka jokaisen opiskelijan ja tutkijan tulisi olla perehtynyt. Molekulaarinen kloonaus käyttämällä erään tyyppistä entsyymiä, jota kutsutaan restriktioentsyymiksi, ihmisen DNA: n leikkaamiseksi fragmenteiksi, jotka voidaan sitten insertoida bakteerisolun plasmidi-DNA: han. Restriktioentsyymit katkaisevat kaksijuosteisen DNA: n puoleen. Restriktioentsyymistä riippuen leikkaus voi johtaa joko tarttuvaan päähän tai tylpään päähän. Sticky päät ovat käyttökelpoisempia molekyylikloonauksessa, koska ne varmistavat, että ihmisen DNA-fragmentti työnnetään plasmidiin oikeaan suuntaan. Ligaatioprosessi tai DNA-fragmenttien fuusiointi vaatii vähemmän DNA: ta, kun DNA: lla on tahmeat päät. Viimeiseksi, useat tarttuvan pään restriktioentsyymit voivat tuottaa saman tarttuvan pään, vaikka kukin entsyymi tunnistaa erilaisen restriktiosekvenssin. Tämä lisää todennäköisyyttä, että kiinnostava DNA-alue voidaan leikata tarttuvilla päätyentsyymeillä.
Rajoittavat entsyymit ja rajoitussivustot
Restriktioentsyymit ovat entsyymejä, jotka leikkaavat tunnistamaan spesifiset sekvenssit kaksijuosteisessa DNA: ssa ja katkaisevat DNA: n puoleen siinä sekvenssissä. Tunnistettua sekvenssiä kutsutaan restriktiopaikaksi. Restriktioentsyymejä kutsutaan endonukleaaseiksi, koska ne leikkaavat kaksijuosteisen DNA: n, kuten DNA on normaalisti olemassa, paikoissa, jotka ovat DNA: n päiden välissä. On yli 90 erilaista restriktioentsyymiä. Jokainen tunnistaa erillisen restriktiokohdan. Restriktioentsyymit pilkkovat vastaavat restriktiokohtansa 5000 kertaa tehokkaammin kuin muut kohdat, joita he eivät tunnista.
Oikea suunta
Restriktioentsyymit jaetaan kahteen yleiseen luokkaan. He joko leikkaavat DNA: n tarttuviin päihin tai tylpiksi. Tarttuvassa päässä on lyhyt nukleotidialue, DNA: n rakennuspalikoita, joka on pariton. Tätä paritonta aluetta kutsutaan ylityksenä. Ylityksen sanotaan olevan tahmea, koska se haluaa ja pariutuu toisen tarttuvan pään kanssa, jolla on komplementaarinen ylitysjärjestys. Sticky päät ovat kuin pitkät kadonneet kaksoset, jotka yrittävät halata toisiaan tiiviisti tapaamisensa jälkeen. Toisaalta tylsät päät eivät ole tahmeita, koska kaikki nukleotidit on jo pariksi muodostettu kahden DNA-juosteen väliin. Tarttuvien päiden etuna on, että ihmisen DNA: n fragmentti mahtuu bakteeriplasmidiin vain yhteen suuntaan. Sitä vastoin, jos sekä ihmisen DNA: lla että bakteeriplasmidilla on tylsät päät, ihmisen DNA voidaan insertoida pään-hännän tai häntä-päähän plasmidiin.
Sticky Endejen ligatointi vaatii vähemmän DNA: ta
Vaikka tarttuvilla päillä olevalla DNA: lla on helpompi löytää toisiaan niiden "tarttuvuuden" vuoksi, niin tahmeat päät eivätkään tylpät päät eivät voi sulautua yhteen jatkuvaksi DNA-kappaleeksi. Jatkuvan, kokonaan kytketyn DNA-kappaleen muodostaminen vaatii entsyymin, nimeltään ligaasi. Ligaasit yhdistävät nukleotidien rungot tarttuvissa tai tylsissä päissä, jolloin muodostuu jatkuva nukleotidiketju. Koska tahmeat päät löytävät toisiaan nopeammin vetovoimansa vuoksi toisiinsa, ligaatioprosessi vaatii vähemmän ihmisen DNA: ta ja vähemmän plasmidi-DNA: ta. DNA: n ja plasmidien tylsät päät löytävät vähemmän todennäköisesti toisiaan, ja täten tylppien päiden ligointi vaatii, että enemmän DNA: ta laitetaan koeputkeen.
Eri entsyymit voivat antaa saman tahmean lopun
Restriktiopaikat sijaitsevat kaikkialla organismien genomissa, mutta eivät ole tasavälein toisistaan. Plasmideissa ne voidaan suunnitella sijaitsevan aivan vierekkäin. Tutkijoiden, jotka haluavat leikata ihmisen DNA-fragmentin ihmisen genomista, on löydettävä restriktiopaikat, jotka ovat fragmentin alueen edessä ja takana. Sen lisäksi, että varmistetaan, että DNA-fragmentti insertoidaan oikeaan suuntaan, eri tahmeat päätyentsyymit voivat luoda saman tarttuvan pään, vaikka ne tunnistavatkin erilaisia restriktiosekvenssejä. Esimerkiksi BamHI: llä, BglII: lla ja Sau3A: lla on erilaiset tunnistussekvenssit, mutta ne tuottavat saman GATC-tarttuvan pään. Tämä lisää todennäköisyyttä, että siellä on tarttuvia pään restriktiokohtia, jotka reunustavat kiinnostavaa ihmisen geeniäsi.