Sisältö
Kemiallisissa reaktioissa, joita entsyymi katalysoi, entsyymi vähentää tarvittavaa aktivointienergian määrää sitoutumalla väliaikaisesti substraattiin ja kiertämällä sitä kiristyneeseen tilaan. Reaktion k (katalyytti) tai "kcat" viittaa pitoisuudesta riippumattomaan vakioon nopeudella, jolla tietty entsyymi voi metaboloida substraatin tuotemolekyyliksi. Kcat-arvon laskemiseksi tutkijat sekoittavat ensin useita koeputkia vaihtelevien substraattipitoisuuksien kanssa (tunnetaan nimellä "entsymaattinen määritys") ja testataan ne vakioaikavälein kevyellä spektrofotometrillä tuotemolekyylien kasvavien pitoisuuksien mittaamiseksi. Nämä tiedot piirretään sitten kuvaajalle ja analysoidaan.
Aloitusnopeuksien laskeminen
Piirrä kaavio tuotteen pitoisuudesta ajan suhteen entsymaattisten määritysten ensimmäisen koeputken tietojen perusteella. Huomaa: vaaka-akselin tulisi olla "aika" ja pystyakselin "tuotteen pitoisuus".
Laske lineaarinen regressioviiva jaksossa 1 vaiheessa 1 piirrettyille datapisteille. Vaikka Excel ja graafiset laskimet voivat helposti määrittää tämän lineaarisen mallin, voit saada arvion regressioviivojen kaltevuudesta jakamalla tuotteen pitoisuusero vierekkäisten tietojen välillä pistettä niiden aikaeron perusteella.
Tallenna lineaarisen regressioviivan kaltevuus osiosta 1, vaihe 2 "reaktion aloitusnopeutena (Vo)". Huomaa: regressioviivamallissa "= m + b", kerroin "m" on kaltevuus.
Toista vaiheet 1, 2 ja 3 muille koeputkille määrityksessä.
Lasketaan Vmax
Piirrä jokaisen koeputken substraattipitoisuuden käänteinen verrattuna sen alkuperäisen reaktionopeuden käänteiseen suuntaan (luvusta 1, vaihe 4). Esimerkiksi, jos kokonaisnopeus koeputkelle, jonka substraattipitoisuus oli 50 mikromolaaria (uM), oli 80 uM / s, käänteiset arvot olisivat 1/50 uM substraattipitoisuudelle ja 1/80 uM / s alkuperäiselle nopeus. Huomaa: käänteisen substraattipitoisuuden tulisi olla vaaka-akselilla ja käänteisen alkuperäisen nopeuden tulisi olla pystyakselilla.
Huomaa: substraatin pitoisuuden tulisi olla vaaka-akselilla, ja reaktion aloitusnopeuden tulisi olla pystyakselilla.
Määritä jakson 2 vaiheessa 1 piirretyn kaavion lineaarinen regressioviiva. Huomaa: koska joudut tuntemaan regressiorivin y-leikkauspisteen, sinun tulee syöttää pisteet luvun 2 vaiheesta 1 joko Exceliin tai a piirtää laskinta ja käyttää sisäänrakennettua regressiomallinnustoimintoa.
Jaa 1 y-leikkauksella lineaarisesta regressioviirasta. Tämä antaa sinulle Vmax-käänteisen arvon, entsyymin enimmäisreaktionopeuden. Huomaa: jos lineaarinen regressiomalli on muodossa "= m + b", niin "b" -arvo olisi y-leikkauspiste. Jaa 1 "b": llä laskeaksesi Vmax-käänteen.
Jaa 1 tuloksella luvun 2 vaiheesta 3 laskeaksesi Vmax: n todellisen arvon.
Määritä entsyymin pitoisuus alkuperäisessä määrityksessä (katso raakatiedot). Huomaa: entsyymikonsentraatio on sama kaikissa koeputkissa; vain substraattipitoisuudet vaihtelevat määrityksessä.
Jaa Vmax (jaksosta 2, vaihe 4) entsyymikonsentraatiolla (jaksosta 2, vaihe 5). Tuloksena on Kcat-arvo.